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安達 基泰; 清水 瑠美; 黒木 良太; Blaber, M.
Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.953 - 957, 2013/11
被引用回数：2 パーセンタイル：13.13(Instruments & Instrumentation)Symfoil-4Pは、ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子を基に設計した3回対称なベータトレフォイル構造をもつ人工タンパク質である。脱アミド反応を防ぐためにアスパラギン-グリシン配列を除去した変異体Symfoil-QGおよびSymfoil-SGを作製し、さらにSymfoil-QGにHisTagを付加したものをHis-Symfoil-IIとした。His-Symfoil-IIは、プロテアーゼ処理によりHisTagを除去することで、完全な3回繰り返し配列をもつことになる。各タンパク質は、大腸菌内で可溶性タンパク質として発現し、Niカラムにより精製した。Symfoil-IIについては、HisTagをプロテアーゼ処理により除去した後に陰イオン交換カラムを用いて精製した。Symfoil-QGとSymfoil-IIをそれぞれ、1.5および1.1
分解能で結晶構造解析した。精密化したSymfoil-IIは、他のSymfoilと同等に疑似3回軸を持っていることが示された。
-glucanase from 
有森 貴夫*; 伊藤 彰紘*; 中澤 昌美*; 上田 光宏*; 玉田 太郎
Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.884 - 889, 2013/11
被引用回数：17 パーセンタイル：65.37(Instruments & Instrumentation)セルロースを含む木質バイオマスからのバイオエタノール生産における糖化プロセスにおいて、(293K以下でも十分な活性を示す)低温寛容性セルラーゼを用いることができれば、加熱するためのエネルギーを節約できるだけではなく、並行複発酵による高濃度アルコール生産が可能となる。GHファミリー9に属するシマミミズ由来1,4--エンドグルカナーゼ(EF-EG2)は313Kにおいて最大活性を示すが、283Kにおいても比較的高い活性を保持する。酵母を用いた組換え型EF-EG2の発現系を構築し、引き続き試料精製および結晶化を実施したところ、回折実験可能な針状結晶を得ることに成功した。この結晶を用いて放射光施設において1.5分解能の回折データを収集し、結晶学的
値が14.7%(free-値が16.8%)まで精密化を完了した。EF-EG2の全体構造は(
/)
バレルから成り、その中心に活性部位と想定されるクレフトが確認された。また、分子表面は負電荷に富んでいたが、この特徴は構造既知の低温寛容性酵素においても広く観察されており、EF-EG2の低温寛容性との関連が示唆された。
-glucosyltransferase from 
廣本 武史; 本庄 栄二郎*; 玉田 太郎; 野田 尚信*; 数馬 恒平*; 鈴木 正彦*; 黒木 良太
Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.894 - 898, 2013/11
被引用回数：38 パーセンタイル：86.45(Instruments & Instrumentation)チョウマメの花弁には、テルナチンと呼ばれるポリアシル化アントシアニンが含まれている。その生合成の最初の段階を担うのがUDP-グルコース:アントシアニジン3--グルコシルトランスフェラーゼ(
3GT-A)であり、UDP-グルコースを糖供与体とし、糖受容体であるアントシアニジン類への糖転移反応を触媒する。ここでは3GT-Aの構造機能相関を明らかにするため、3GT-Aの大腸菌組換え体を調製し、その立体構造をX線結晶構造解析により1.85分解能で決定した。その全体構造は、2つのRossmann-like //ドメインから成るGT-Bフォールドを有しており、また2つのドメイン間に形成されたクレフトには、糖供与体(UDP-Glc)および糖受容体を結合するキャビティが存在していた。既に報告されている赤ブドウ由来フラボノイド3--グリコシルトランスフェラーゼ(
GT1)との構造比較より、糖受容体であるケンフェロールの結合に関与するアミノ酸残基が3GT-Aにおいて有意に置換されていることが明らかとなった。これらの知見は、両酵素の糖受容体特異性の差別化を理解する上で重要と考えられる。
日下 勝弘*; 細谷 孝明*; 山田 太郎*; 友寄 克亮; 大原 高志; 片桐 政樹*; 栗原 和男; 田中 伊知朗*; 新村 信雄*
Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.994 - 998, 2013/11
被引用回数：37 パーセンタイル：85.87(Instruments & Instrumentation)茨城生命物質構造解析装置iBIXは、主にあらゆる生命維持に関わる生体巨大分子の水素、プロトネーションや水和構造解明を目的とした飛行時間型中性子単結晶回折計である。2008年後半から、iBIXは茨城大学の支援によりユーザ実験に利用されている。2012年8月から既存の14台の検出器の更新が行われ、16台の新しい検出器がiBIXに設置された。現在の回折計の測定効率は、加速器出力の増加に伴い、以前の測定効率に比べて1オーダ改善した。2012年12月には、アップグレードされた検出器を用いた運用のコミッショニングに成功し、標準蛋白質であるリボヌクレアーゼAの回折データセット収集が試みられた。検出器アップグレード以前データ収集を行ったリボヌクレアーゼAの結果と比較し、最新のiBIXの性能評価を実施した結果、回折データの分解能、等価反射強度および構造精密化のR-factorが劇的に改善した。iBIXは世界で最も高性能な生物専用の中性子単結晶回折装置の一つであると予想される。
横山 武司*; 水口 峰之*; 鍋島 裕子*; 日下 勝弘*; 山田 太郎*; 細谷 孝明*; 大原 高志; 栗原 和男; 田中 伊知朗*; 新村 信雄*
Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.834 - 837, 2013/11
被引用回数：6 パーセンタイル：33.51(Instruments & Instrumentation)トランスサイレチン(TTR)は4量体で形成されるタンパク質である。TTRの誤った折り畳みや凝集はヒトのアミロイド疾患と関連がある。また、TTR四量体の解離はアミロイド線維形成カスケードの律速段階であると信じられている。さらに、低いpHは単量体への解離とアミロイド線維の形成を促進すると知られている。これらTTRのpH感受性と立体構造安定性に内在する分子機構を明らかにするために、茨城県生命物質構造解析装置を用いた飛行時間法による中性子回折実験を行った。本実験では、2.5mm
の体積を持つ結晶(育成期間: 4か月)を使用した。2.0分解能での中性子結晶構造解析の結果から、ヒスチジン88番残基のプロトン化状態とその状態に依存する水素結合ネットワークの詳細が明らかになった。この水素結合ネットワークは単量体・単量体間と二量体・二量体間の相互作用に関わっており、この結果から、酸性化によるヒスチジン88番残基の二重プロトン化がその水素結合ネットワークを破壊しTTR四量体の解離を引き起こすことが示唆された。また、酸性pHでのX線結晶構造との比較から、TTRのpH感受性の要因となる3つのアミノ酸残基が同定された。我々の中性子結晶構造モデルは、アミロイド症に関連する分子構造安定性を理解する上での手掛かりとなる。
-lactamase TOHO-1栗原 和男
no journal, ,
To help resolve questions regarding the catalytic activity of -lactamase, the crystal structure of an unliganded form of the -lactamase Toho-1 with double mutation R274N/R276N (Toho-1/NN) has been determined by the use of high-resolution neutron and X-ray diffraction data. The double mutation was introduced to improve the diffraction quality of Toho-1 because the wild type Toho-1 tends to form merohedrally twinned crystals. A large single crystal of Toho-1/NN with a dimension of 2.6 
2.5 1.3 mm was used to collect both 100 K neutron diffraction data up to 1.5 resolution and X-ray diffraction data up to 1.4 resolution. The structural model of Toho-1/NN was refined to an 
-factor of 19.7% using the program 
. The Fourier map showed that Glu166, a catalytic residue of Toho-1, was protonated even at pD 7 in spite of the close location to the positively charged side-chain amino group (-NH3
) of Lys73. It is also found that there is the hydration water network bridging between the protonated Glu166 and the oxyanion hole comprising two main-chain nitrogen atoms of Ser70 and Ser237. The neutron structure analysis also revealed the clear configuration of the proposed catalytic water molecule bridging Glu166 and Ser70. These observations are important to understand the catalytic action of -lactamase Toho-1.
-glucanase from Eisenia foetida有森 貴夫*; 伊藤 彰紘*; 中澤 昌美*; 上田 光宏*; 玉田 太郎
no journal, ,
We cloned the gene for endo-1,4--glucanase from Eisenia foetida (EF-EG2) consisting of 1368 bp encoding 456 amino acid residues. The amino acid sequence of the gene shares sequence homology (
50%) with endo-1,4--glucanases belonging to glycoside hydrolase family 9. The recombinant EF-EG2 showed highest activity at 40
C, and also retained a comparatively high activity at 10C. We purified the recombinant EF-EG2 expressed in Pichia pastoris, and then grew needle shaped EF-EG2 crystals with dimensions of 0.02 0.02 1 mm. Diffraction data of EF-EG2 was collected at beamline 1A, Photon Factory, KEK, and integrated and scaled to 2.1 resolution. The crystals belonged to space group 
3
21 with unit-cell parameters of 
= 
= 135 , 
=54.9 . The location of one EF-EG2 molecule in the asymmetric unit was identified by molecular replacement analysis using the coordinates of endoglucanase from Nasutitermes takasagoensis (NtEgl). The final model of EF-EG2 was refined to a crystallographic -factor of 17.9% (free R-factor of 21.4%) to 2.1 resolution. Overall structure of EF-EG2 is similar to that of NtEgl with an RMSD value of 0.9 for 423 C atoms, however, a slight difference between both structures was confirmed around substrate binding site.
- glucosyltransferase from 廣本 武史; 本庄 栄二郎*; 玉田 太郎; 黒木 良太
no journal, ,
UDP-glucose: anthocyanidin 3--glucosyltransferase from (3GT-A; AB185904) is an enzyme that catalyses glucosyl transfer from UDP-glucose to anthocyanidins such as delphinidin, which is the first step of ternatin biosynthesis (Kogawa 
., 2007). The recombinant wild-type enzyme was expressed in 
cells, purified to homogeneity and crystallized. The X-ray diffraction data set was collected at PF-BL6A using a crystal with a size of 0.05 0.05 0.5 mm, which belongs to the space group 2
with cell dimensions of = 50.2 , = 55.2 , = 86.2 and = 105.1 . The initial phase was solved by MR using the coordinates of a homologous glucosyltransferase GT1 from 
(PDB ID: 2C1Z) as a search model. The overall structure of 3GT-A shows a typical GT-B fold comprising two Rossmann-like // domains. The putative binding sites for UDP-glucose and delphinidin are located in a deep cleft between the N- and C-terminal domains. Structural homology searches by Dali server indicated that 3GT-A is similar to the other plant glucosyltransferases GT1 and UGT78G1 from 
with the RMS deviations of 1.9 (for 432 C atoms) and 2.0 (for 437 C atoms), respectively.
石山 新太郎
no journal, ,
60kWmm
の世界砕高輝度を達成したこの字型アノード回転電極を有する高輝度X線発生装置の健全性評価を行うため、3D伝熱解析と構造解析を連成させた動的解析を行った。この字型アノード回転電極は、高速回転中電子ビーム加熱により回転部の一部が局部溶融した状態であるため回転体の回転バランス並びに冷却構造体の健全性を保証する必要がある。しかしながら、当該回転体はコンパクトであることから高速回転時の各負荷部の詳細な温度分布や応力分布等を計測することが困難なことから、構造解析評価を行う必要がある。そのためには、一部溶融を許した回転体の温度解析から始まり、その情報を構造解析情報として解析モデルに取り込み、この伝熱と構造解析それぞれの過程を連成させながら収束させる伝熱-構造連成解析技術の開発が必要である。そこで本研究では、この字型アノード回転電極モデルの伝熱-連成解析を行い、その結果得られた高速回転時のこの字型アノード回転電極の発生温度,応力並びにひずみに関する分析を行い、本連成解析の合理性並びに高速運転時の構造安全性に関する検討を行った。
安達 基泰; 清水 瑠美; 黒木 良太; Blaber, M.
no journal, ,
ヒト線維芽細胞増殖因子(hFGF)の立体構造情報をもとにして創製した、三回繰り返し配列を有する人工タンパク質(Symfoil)に関して、さらに高い分解能による立体構造情報の取得を目指している。今回、Symfoilの化学的に不安定な配列の除去と繰り返し配列の完全性の向上したSymfoil改変体(Symfoil-II)を設計した。Symfoil-IIは、大腸菌を用いて可溶性分画に発現させた後、Niキレートカラムにより精製し、さらにプロテアーゼ消化によってHisTagを除去したものを陰イオン交換HPLCにより精製した。その後Symfoilの二次構造形成を円偏光二色性スペクトルで確認した。精製試料の収量は、培地1Lあたり約15mgであった。精製したSymfoil-IIは、Symfoilと同様の結晶化条件(1.8M(NH
)SO, 0.1M TrisHCl pH7.0)で結晶化した。実験室系のX線回折計による予備実験によって1.9分解能の回折データを取得し、分子置換法で位相を決定した結果、Symfoilとは異なる結晶内分子パッキングを持つが、同様の高い対称性立体構造を有することがわかった。
